通用RNA提取試劑盒

產(chǎn)品組分

需要自備的溶液

●  氯仿

●  無水乙醇

產(chǎn)品說明

通用RNA提取試劑盒是經(jīng)過改進開發(fā)的新一代產(chǎn)品，提高了裂解液的裂解能力和提取的靈敏度，通過在特定適宜的條件下特異、可逆地結(jié)合RNA，而各種蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)均可被去除掉，同時改進的硅基質(zhì)膜增強了對RNA的吸附能力，得到的RNA純度更好，質(zhì)量更高。該試劑盒可從各種細胞或組織中快速提取總RNA，每個吸附柱每次可處理50–100 mg 組織或5×10⁶ 細胞，可同時處理大量不同樣品，一個小時內(nèi)即可完成反應(yīng)。提取的總RNA沒有DNA和蛋白的污染，可用于Northern blot、Dot blot、polyA 篩選、體外翻譯、RNase保護分析和分子克隆等。

保存條件

溶液RL應(yīng)在2-8℃避光保存，其他溶液和純化柱室溫保存。

注意事項---------------------------------------------------------------------------------------------------------
●  初次使用溶液RPI和溶液RW前，需按比例加入無水乙醇。18 ml溶液RPI中加入12 ml無水乙醇（3:2），12 ml溶液RW中加入48 ml無水乙醇（1:4）。

●  嚴防操作環(huán)境、使用的容器、耗材和試劑的RNase污染。操作過程中勤換手套。

●  使用本產(chǎn)品提取的RNA一般不含有DNA污染。在極少數(shù)情況下（與組織pH值等相關(guān)），如果有DNA污染而又必須去除，則可以用RNase-free的DNase處理樣品。

●  請嚴格遵照操作步驟操作。

●  不同起始材料的用量及溶液RL的用量不同（參見下表），過多或過少的使用量都可能影響RNA的質(zhì)量或產(chǎn)量。若起始材料量很少，RNA預(yù)計產(chǎn)量很低，在異丙醇沉淀時，可加入20mg/ml的肝糖原溶液0.5-1 μl促進RNA沉淀。

●  有關(guān)RNA的吸光度說明如下：

260nm、320nm、230nm、280nm下的吸光度分別代表核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白質(zhì)等有機物的污染程度，質(zhì)量較好的RNA的R值應(yīng)在1.8-2.0之間，當(dāng)R<1.8時，溶液中的蛋白質(zhì)等有機物的污染比較明顯；當(dāng)>2.2時，說明RNA已經(jīng)被水解成單核苷酸。

●  RNA濃度=（OD₂₆₀-OD₃₂₀）*稀釋倍數(shù)*0.04 μg/μl。

操作步驟---------------------------------------------------------------------------------------------------------

第一次使用前應(yīng)在溶液 RPI、溶液 RW中加入無水乙醇，加入量請參見瓶上標簽。

1.  樣品處理

● 組織：將組織在液氮中磨碎。每50–100 mg組織加1 ml溶液RL，用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過溶液RL體積的十分之一。

● 單層培養(yǎng)細胞：直接在培養(yǎng)板中加入溶液RL裂解細胞，每10 cm² 面積加1 ml溶液RL。用取樣器抽打幾次。

●  溶液RL的加入量根據(jù)培養(yǎng)瓶面積決定，不是由細胞數(shù)決定。如果加量不足，可能導(dǎo)致提取的RNA中有DNA污染。

c.  細胞懸液：離心取細胞，棄上清。每5–10×10⁶動物細胞和植物細胞加入1 ml溶液RL。加溶液RL前不要洗滌細胞，以免降解mRNA。

2.  將勻漿樣品在15–30℃放置5 min，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3.  可選步驟：4℃ 12,000 rpm (~13,400×g) 離心5分鐘，取上清，轉(zhuǎn)入一個新的無RNase的離心管中。

●  如果樣品中含有較多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物結(jié)節(jié)部分等，可加此步驟離心去除。離心得到的沉淀中包括細胞外膜、多糖、高分子量DNA，RNA存在于上清溶液中。

（如樣品含有較多多糖多酚，請增加以下步驟，在上清液中加入0.2×上清液體積的5 M NaCl及1×上清液體積的酚/氯仿（1:1），混勻，12000 rpm 離心5-10 min ，取上清液加入等體積氯仿，混勻，12000 rpm 離心5-10 min，至第4步。）

4.  加入200 μl氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min。

5.  4℃ 12,000 rpm離心10 min，樣品會分成三層，從上至下依次是：無色的水相，白色的中間層和黃色的有機相，RNA主要存在于水相中，水相的體積約為所用溶液RL試劑的60%。把水相轉(zhuǎn)移到新管中，進行下一步操作。注意不要吸到中間層。

●  第一次使用前應(yīng)在溶液 RPI、溶液RW中加入無水乙醇，加入量請參見瓶上標簽。

6.  緩慢加入0.5 倍體積無水乙醇，混勻（此時可能會出現(xiàn)沉淀）。將得到溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入純化柱中，4℃ 12,000 rpm離心30 s。4℃ 12,000 rpm離心30 s，棄掉收集管中的廢液。
●  若溶液體積大于純化柱容積（700 μl），可分兩次離心。

7.  向純化柱中加入500 μl溶液RPI（使用前請先檢查是否已加入乙醇），4℃ 12,000 rpm離心30 s，棄廢液。    

8.  向純化柱中加入500 μl溶液RW（使用前請先檢查是否已加入乙醇），室溫靜置2 min， 4℃ 12,000 rpm離心30 s，棄廢液。

9.  向純化柱中加入500 μl溶液RW，室溫靜置2分鐘，4℃ 12,000 rpm離心30 s，去除殘余液體。

10.  將純化柱放入2ml收集管中，4℃ 12,000 rpm離心2 min，去除殘余液體。

●  此步驟的目的是將純化柱中殘余的漂洗液去除，離心后將純化柱在室溫放置片刻，或置于超凈工作臺上通風(fēng)片刻，以充分晾干。如果有漂洗液殘留，可能會影響后續(xù)的RT等實驗操作。

11.  將純化柱轉(zhuǎn)入一個新的離心管中，加30–100 μl RNase-free ddH₂O，室溫放置2 min，4℃ 12,000 rpm離心2 min。

●  洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于30 μl，體積過小影響回收效率。且RNA應(yīng)保存在-70℃（-80℃），以防降解。

●  如果想提高RNA得率，可重復(fù)上步操作一次，合并兩次得到的溶液。