要先對PCR目的序列的長度有個大致估計：

第一步：找到Primer3的站點。你不用記住這個站點，但是要記住“Primer3”這個詞，然后打開GOOGLE首頁，輸入Primer3，跳出來的第一個項目就是了“Primer3 Input 0.4.0 (primer3-web/htdocs/input-040.htm)”

網(wǎng)址是http://frodo.wi.mit.edu/。

第二步：貼上模板序列。進入Primer3站點，可以看到一個引物設(shè)計的界面。在“Paste source sequence below (5'->3'…..”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖進去。注意是5'->3'方向的，數(shù)字或者空格都沒關(guān)系，軟件會自動過濾的。

第三步：重要參數(shù)設(shè)定。首先是“Product Size Ranges”，如果你不希望軟件給你隨便做的話，首先要調(diào)整的就是這個參數(shù)。默認(rèn)的參數(shù)實際上是從100到1000，這個你得自己改，如果你希望產(chǎn)物的大小符合你的預(yù)期，盡可能把范圍改小，比如480-500，具體看情況調(diào)整。第二個參數(shù)是“Primer Size”，默認(rèn)值一般可以用，但是，當(dāng)你用熟了這個軟件，你自己就知道該怎么改了。第三個參數(shù)是”Primer Tm”這個和Primer Size差不多。

第四步：Pick primers： 點一下這個按鈕，符合你大小預(yù)期的primer就出來了，看看Primer3 Output的界面，多么漂亮！你要的primer出來了，而且有primer在序列上的位置比對圖，還要primer本身的信息，包括位置，長度，Tm，GC含量，任何位置互補堿基數(shù)，3'端互補堿基數(shù)，以及引物序列，（注意，下游引物是5'->3'），還要產(chǎn)物大小，兩引物間任意互補堿基數(shù)，兩引物間3'端互補堿基數(shù)等。如果引物尚在參數(shù)設(shè)定的范圍內(nèi)，但還不是最佳，將會給出警告。

第五步：引物設(shè)計檢驗：可以僅僅設(shè)計一向引物，只要在Pick left primer或者Pick right primer前面的勾勾掉一個就可以。也可以自己定義引物，放在Primer框里，（注意，下游引物的書寫反向仍然是5'->3'）如果符合設(shè)定的條件，軟件將對給出引物評分，同時給出警告信息，根據(jù)警告信息可以適當(dāng)對自定義引物做些調(diào)整即可，警告信息也讓你做實驗的時候心中有數(shù)。對于文獻發(fā)表的引物，最好都要檢查一下，這樣就可以避免被別人有意無意誤導(dǎo)。至于RT-PCR所用的引物，最好是使得產(chǎn)物跨過內(nèi)含子，這樣避免潛在DNA對RT-PCR的干擾。實際做引物的時候，要把內(nèi)含子都去掉，僅僅把外顯子序列放入源序列框中，并且通過自定義引物設(shè)計的方法，使上下游引物分別全部或者部分落在不同外顯子上。至于如何快速識別內(nèi)含子和外顯子以及電子PCR，我將抽空另做說明。

至于設(shè)計出來的引物的實際效果，根據(jù)我的經(jīng)驗，一般情況下都能做到PCR一次成功，也許隨便那一段序列做引物也能達到很好的效果，但是不管怎么說，軟件做引物可以讓自己心中有數(shù)。最后，GOOD LUCK TO EVERYONE.