連接接頭建庫是目前市場上應(yīng)用比較廣泛的技術(shù)，其建庫方式已經(jīng)很成熟。

基本過程是：首先通過物理打斷或酶切打斷的方式將提取好的基因組DNA片段化，片段化后的DNA末端需要進(jìn)行補(bǔ)平修復(fù)和加A，再在DNA連接酶的作用下，再連接上接頭，最后通過PCR擴(kuò)增，中間再穿插著純化/分選步驟就完成了文庫的構(gòu)建。

優(yōu)點(diǎn)：末修連接法建庫可以有效保留樣本幾乎所有基因組信息，非常有利于未知拷貝數(shù)和基因組變異的檢測，是全基因組測序和外顯子測序的主要建庫手段。

缺點(diǎn)：建庫過程中步驟相對較多，中間還穿插了多次的磁珠純化，繁瑣步驟容易造成誤差。

1.轉(zhuǎn)座子用于測序文庫構(gòu)建時(shí)，將DNA片段化、末端修復(fù)、接頭連接等多步反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)?步反應(yīng)，極大縮短建庫時(shí)間，提高工作效率。

1.對DNA的純度和DNA濃度準(zhǔn)確性要求較高，否則會(huì)影響打斷的效果。

PCR擴(kuò)增子建庫流程

優(yōu)點(diǎn)：

1.PCR擴(kuò)增子建庫通過定制引物Panel完成文庫構(gòu)建。PCR擴(kuò)增子建庫方法具有臨床應(yīng)用性，可以針對疾病目標(biāo)基因進(jìn)行捕獲，提高目標(biāo)基因檢測的覆蓋度和測序深度，解釋臨床結(jié)果。

2.PCR擴(kuò)增子方法建庫可以通過單次測序反應(yīng)檢測更多患者樣本，大大減少后期生信分析的任務(wù)，獲得的數(shù)據(jù)更易于儲存和管理。

缺點(diǎn)：

1.PCR擴(kuò)增子建庫應(yīng)用于全外顯子或全基因組建庫時(shí)，由于設(shè)計(jì)出的引物不能完全擴(kuò)增出所有的待測片段會(huì)導(dǎo)致最終的文庫覆蓋率較低。

2.當(dāng)擴(kuò)增子之間有重疊時(shí)，為了避免重疊部分產(chǎn)生的短擴(kuò)增子的優(yōu)勢擴(kuò)增的影響，需要有兩個(gè)或多個(gè)引物池，這樣就會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)流程復(fù)雜且增加成本。

3.應(yīng)用在mNGS檢測上，需要對致病菌有提前的預(yù)判，也違背了mNGS檢測無偏倚性的初衷，同時(shí)如果引物Panel設(shè)計(jì)的不夠全面，容易出現(xiàn)漏檢的情況。

4.多重PCR反應(yīng)中容易出現(xiàn)引物二聚體的積累，引物二聚體的擴(kuò)增會(huì)大量消耗引物本身和體系中其他的原料，甚至有抑制所需DNA序列擴(kuò)增的效果。